说明

一般描述

广泛使用的方法用于确定凋亡，包括基于琼脂糖凝胶电泳的基因组DNA分析以及基于3H-胸苷或5-溴-2′-脱氧-尿苷的DNA片段检测。该方法包含在特定的细胞群中将片段化的低分子量DNA与未片段化的高分子量DNA进行分离。因此，这些方法并不提供关于在特定细胞群或特别是组织切片中某个独立细胞命运的信息。或者，独立的凋亡细胞可能因其特征性的核染色质堆叠和片段而可通过显微镜进行识别，但这种方法具有主观性并受限于形态发生 变化这一相对窄的时间窗口。
凋亡的标志是DNA的降解，而这在早期是对核小体间DNA连接体区域是有选择性的。DNA的切割可能会产生双链和单链的DNA断裂（切口）。两种类型的断裂都可在酶促反应中利用修饰的核苷酸（如生物素-dUTP、DIG-dUTP、荧光素-dUTP）的游离3′-OH端标记而被检测到。这些酶末端转脱氧核苷酰酶（TdT）可催化脱氧核糖核苷酸的模板非依赖性聚合至单链及双链DNA的 3′-末端。这种方法也被称之为TUNEL(TdT-介导的 dUTP-X缺口 末端标记)。或者，游离的3′-OH基团可能通过一种称为切口翻译的模板依赖机制而利用DNA聚合酶被标记。然而，TUNEL法被视为更为敏感且快速的。

样品材料：位于悬浮液、细胞离心涂片器以及细胞涂片制品中的细胞，生长于玻片上的粘附细胞以及冷冻和石蜡包埋的组织切片。

原理
原位细胞死亡检测试剂盒，TMR红是基于在凋亡的早期对单链和双链DNA的断裂进行检测。
凋亡的细胞是经过固定和通透化处理的。随后，这些细胞采用含有TdT以及TMR-dUTP的TUNEL反应混合物进行孵育。在孵育阶段，TdT可催化在单链和双链DNA的游离3′-OH基团上加上TMR-dUTP。在洗涤后，在DNA受损位点插入的标记可通过流式细胞仪或荧光显微镜进行可视化。

试剂盒用于利用荧光显微镜和流式细胞仪在单细胞水平对凋亡性细胞死亡进行检测和定量，以及用于利用荧光素标记的细胞标志物（TMR红）进行双标记。

特异性

TUNEL反应倾向于对在凋亡过程中产生的DNA链断裂进行标记。这能够将凋亡与坏死以及由细胞增殖抑制药物或放射诱导的初级DNA链断裂进行区分。

应用

原位细胞死亡检测试剂盒，TMR红已用于末端脱氧核苷酸转移酶生物素-dUTP切口末端标记（TUNEL）检测。[1][2]它已用于凋亡检测。[3][4]

精准、快速而简单的技术，用于利用荧光显微镜和流式细胞仪对带有红色荧光标记的细胞和组织在单细胞水平对凋亡的DNA片段进行检测和定量。[5][6]

包装

1个试剂盒包含2种组分。

制备说明

工作浓度：酶浓度
的酶浓度范围在单个检测0.5至5 U。对于标准的50 μl PCR，我们建议使用2 U的酶混合物。
工作溶液：将全部体积（50 μl）的酶溶液加入至剩下的450 μl标记溶液以获得500 μl TUNEL反应混合物。
充分混合以平衡组分。
储备条件 (工作溶液)：TUNEL反应混合物应当在立即使用前进行制备而不应当进行储备。将TUNEL反应混合物置于冰上直至使用。

TUNEL反应混合物通过将酶融合和标记溶液在使用前混合而制备。

其他说明

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