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辣根过氧化物酶
过氧化物酶（HRP）广泛分布于植物中，辣根中含量 ，从辣根中提取的称辣根过氧化物酶（HRP），是由无色酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖蛋白（含糖量18%），分子量约40 000，约由300个氨基酸组成，等电点为pH 3-9，催化反应的最适pH值因供氢体不同而稍有差异，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%饱和度以下的硫酸铵溶液。酶蛋白和辅基的 吸收光谱分别为275nm和403nm。
酶的纯度以RZ表示：RZ=OD403/OD275
纯酶的RZ多在3.0以上， 为3.4。RZ在0.6以下的酶制品为粗酶，非酶蛋白约占 75%，不能用于标记。RZ在2.5以上者方可用于标记。HRP的作用底物为过氧化氢，催化反应时的供氢体有几种：⑴邻苯二胺（OPD），产物为橙色，可溶性，敏感性高， 吸收值在490nm，可用肉眼观察判别，容易被浓硫酸终止反应，颜色可在数小时内不改变,是目前国内ELISA中最常用的一种；⑵联大茴香胺（OD），产物为橘黄色， 吸收值在400nm，颜色较稳定；⑶5－氨基水杨酸(5－AS）：产物为深棕色， 吸收值在449nm，部分溶解，敏感性较差；⑷邻联甲苯胺（OT）产物为蓝色， 吸收值在630nm，部分溶解，不稳定，不耐酸，但反应快，颜色明显。
碱性磷酸酶
系从小牛肠粘膜和大肠杆菌中提取，由多个同功酶组成。它们的底物种类很多，常用者为硝基苯磷酸盐，廉价无毒性。酶解产物呈黄色，可溶， 吸收值在400nm。酶的活性以在pH10反应系统中，37℃1分钟水解1μg磷酸苯二钠为一个单位。
标记方法
良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白， 使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。
酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为：将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加硼氢化钠（NaBH4）溶液（5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。
效果测定
测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。
⑴ 酶与抗体的活性 常用琼脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。良好的结合物在显色后，琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可以确定酶标抗体的使用浓度。
⑵ 结合物的定量测定 一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定，然后按下列公式计算：
酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62
对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量，按下列公式计算：
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
已知酶量和IgG量后，即可计算出标记抗体的摩尔（mol）比值。
HRP/IgG摩尔比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4
结合物中酶总量=HRP（mg/ml）×结合物溶液量
结合物产率=结合物中酶总量/标记时加入的酶量×
用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般，为500(g/ml时效果较好，达 1000(g/ml时效果 。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般，1.0时效果较好，1.5-2.0时 。酶结合率为 7%时效果一般，为9%－10%较好，达30%以上时 。

细胞培养技术自20世纪50年代问世以来，经过70年的发展，已经成为一门融细胞生物学、免疫学、生理学、病理学、生物化学、营养学及生物工程技术为一体、结合组织工程等前沿领域的新兴学科。细胞培养技术不仅在生命科学研究中有重要地位，在生物工程领域中，细胞培养技术更是被誉为现代生物工程之母。细胞培养技术广泛应用于医药研究、细胞生产、生物制品制备、药物筛选、毒理学研究、动植物检疫以及航天和国防等领域。

一、细胞培养在医学领域的应用

细胞培养技术在医学领域的应用主要涉及药物筛选、药物毒理学研究、研究以及干细胞等方面。

1. 药物筛选和毒理学研究

在药物筛选和毒理学研究中，细胞培养技术扮演着重要的角色。通过体外培养细胞，可以模拟体内环境，对药物进行筛选和评估，同时也可以研究药物对细胞的毒性作用。利用细胞培养技术，可以快速、准确地检测药物的和安全性，为新药研发提供有力支持。

2.Tumour 研究

细胞的培养为Tumour研究提供了重要的工具。通过Tumour细胞培养，可以深入了解Tumour细胞的生长特性、侵袭能力以及抗药性等方面的信息，为Tumour的诊断和提供依据。同时，Tumour细胞培养也为物的筛选和开发提供了实验模型。

3. 干细胞

干细胞培养是干细胞的重要环节。通过体外培养干细胞，可以获取足够的干细胞用于移植。目前，干细胞已经在的中取得了一定的成果，如、、等。干细胞培养为这些疾病的提供了新的途径。

二、细胞培养在生物工程领域的应用

细胞培养技术在生物工程领域的应用主要涉及动物细胞大规模培养、植物组织培养以及微生物培养等方面。

1. 动物细胞大规模培养

动物细胞大规模培养技术是生物工程领域的重要分支之一。通过动物细胞大规模培养，可以生产出各种生物制品，如干扰素、生长因子、激素等。这些生物制品在医疗、农业和工业等领域有广泛的应用。动物细胞大规模培养技术已经成为生物工程领域的重要支柱产业之一。

2. 植物组织培养

植物组织培养是植物繁殖和基因转移的重要手段之一。通过植物组织培养，可以快速繁殖植物，实现植物的快速生长和育种。此外，植物组织培养还可以用于基因转移和基因编辑等方面，为植物育种和基因工程提供有力支持。

3. 微生物培养

微生物培养是生物工程领域中的一项基础技术。通过微生物培养，可以生产出各种生物制品，如抗生素、酶制剂等。微生物培养技术已经成为工业微生物学和生物工程领域的重要支柱产业之一。

三、结论

细胞培养技术作为现代生物学和生物工程技术的重要组成部分，在医学、生物工程等领域有着广泛的应用前景。随着科学技术的发展，细胞培养技术将不断完善和提高，为生命科学研究和生物工程技术应用提供更加全面和高效的技术支持。