小鼠胰素样肽2(GLP-2)  ELISA 试剂盒

酶联免疫吸附实验 (ELISA) 是一种定性或定量检测，使用抗体来结合并测定目的分子。与其他免疫检测相似，可使用单克隆抗体和多克隆抗体来检测分析物（如肽、蛋白、抗体和小分子）。抗体对分析物产生特异性，并且一部分（如辣根过氧化物酶 [HRP]）直接或间接偶联抗体，从而提供检测方法并实现可能的信号放大。通过多种ELISA方法和检测化学成份，可以让终端用户调整适当的检测，以解决预计的实验问题。该方法可以用于单份样品检测或高通量筛选。

直接 ELISA

在直接 ELISA 中，抗原直接结合微孔板表面，随后添加直接偶联的抗体来结合/检测。简而言之，实验步骤的 步便是将抗原固定在微孔板上。 步是添加一种封闭试剂，防止检测抗体出现非特异性结合。接下来，添加直接偶联某种酶（如 HRP）的检测抗体。该检测抗体将结合抗原，并且剩余的抗体会从孔中洗掉。随后添加这种酶的底物，短暂孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。直接 ELISA 的实验步骤有限，可让实验设置整体简化。

直接法优缺点：

优点：1：快速，仅使用一种抗体且步骤较少；2：消除了 抗体的交叉反应性。

缺点：1：一抗的免疫反应性可能受到酶或标签标记的不利影响；2：为每个特定的ELISA系统标记一抗，既费时又昂贵；3：由于标记的抗体密度较低导致较低的灵敏度；4：抗原的固定化不是特异性的，有较高背景干扰。

间接 ELISA

间接 ELISA 类似于直接 ELISA；但主要的差别在于会通过 偶联抗体来检测结合抗体。实验步骤的 步便是将抗原固定在微孔板上。 步是添加一种封闭试剂，防止结合抗体出现非特异性结合。第三，添加一种抗原特异性结合抗体，短暂孵育后，用缓冲液洗涤板孔，以去除多余的试剂。下一步是“间接”检测，其中添加一种抗体来检测 结合抗体。这种抗体通常偶联某种酶。在孵育和洗涤板孔之后，添加该酶的底物。随后，短暂孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。 抗体通常是一种抗物种抗体。间接 ELISA 的主要优势在于可以使用偶联的 抗体来进行多个实验，前提是在所有不同的实验中使用相同物种的结合抗体。另一个优势是 抗体会放大信号，因为大约 2 个抗体将结合 抗体。随着步骤数量的增加，实验步骤通常会耗时更长，并且更容易出错。此外，背景信号可能会增强，因为所需的试剂数量更多，每一种都可能会出现非特异性结合。

间接法优缺点：

优点：1：可以在一个物种中制备许多一抗，并且可以将相同的标记二抗用于检测；2：由于没有标记，保留了 抗体的 免疫反应性；3：高标记的二抗密度可实现高灵敏度，从而导致信号放大。

缺点：1：二抗可能会发生交叉反应，从而导致非特异性信号；2：这个过程中需要一个额外的孵育步骤

夹心法 ELISA

在夹心 ELISA 中，抗原成为 2 种抗体之间的“三明治”中心。在一种夹心 ELISA 形式中， 抗体被吸收进入微孔板孔中，在洗涤和封闭后，添加含抗原的样品。添加会结合样品分子另一位点的 抗体。这种 抗体通常偶联某种酶，因此它可用来检测。洗涤板孔之后，添加该酶的底物。随后，短暂反应孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。

夹心法优缺点：

优点：1：高特异性，使用的捕获抗体与检测抗体都是检测特异性的；2：适用于复杂样品，抗原不需要进行纯化即可用于检测；3：灵活性更大，灵敏度更高，可采用直接法也可采用间接法。

缺点：1：检测物需要拥有两个以上不同的抗原表位或多个相同的重复表位：2：价格较贵，时间消耗多。

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竞争性ELISA

竞争性/抑制性 ELISA 也称封闭 ELISA，它对干扰预计信号的程度进行定量，以测定分析物的数量。这样做的一个方法是用一种对靶标有特异性的抗体包被平板。靶标可以偶联某种酶，并用于检测。如果实验含有次于 量的检测靶标，则高浓度的未标记靶标会竞争性地结合，从而减弱信号。这类竞争性实验可用来测定某种特异性分析物的水平。

竞争法优缺点：

优点：1：灵敏度高以及灵活性高；2：能测定微量的分析物。

缺点：1：特异性较低；2：需要酶标记的抗原。

阻断ELISA
本法主要用于检测型特异性抗体。该方法现已成为猪（TGE）、猪伪（PR）及猪胸膜（AP）的主要检测方法。下面以AP2型抗体的阻断ELISA检测法为例介绍其操作程序：
① 100μl AP2型工作量抗原包被 → 4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 用200μl阻断缓冲液进行封闭 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
③ 加工作量1:4稀释被检猪血清100μl → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
④ 加100μl工作量兔抗AP2型血清 → 37℃ 30分钟，洗涤三次、抛干
⑤ 加100μl工作量猪抗兔IgG-HRP → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
⑥ 加100μl OPD底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
⑦ 用ELISA检测仪测定OD值。
本试验同时设标准阴、阳性血清对照、兔抗AP2型阳性对照、空白对照。
抗体捕捉ELISA
本法主要用于检测IgM抗体。由于IgM抗体出现于感染早期，所以检测出IgM，则可作为某种疾病的早期诊断。抗体捕捉ELISA根据所用标记方式不同可分为标记抗原、标记抗体、标记抗抗体捕捉ELISA等几种，其中以标记抗原捕捉ELISA比较有代表性，该方法的主要程序为：
① 用抗u链（抗IgM重链）抗体包被→37℃ 60分钟后置4℃过夜，洗涤三次、抛干
② 加待检血清 → 37℃ 2小时，洗涤三次、抛干
③ 加酶标抗原 → 37℃ 60分钟，洗涤三次、抛干
④ 加底物液 → 37℃ 20分钟，加终止液
⑤ 用ELISA检测仪测定OD值。
斑点ELISA
与常规的微量板ELISA比较，Dot-ELISA具有简便、节省抗原等优点，而且结果可长期保存；但其也有不足，主要是在结果判定上比较主观，特异性不够高等。该方法的主要操作程序为：
⑴载体膜的预处理及抗原包被 取硝酸纤维素膜用蒸馏水浸泡后，稍加干燥进行压圈。将阴性、阳性抗原及被检测抗原适度稀释后加入圈中，置37℃使硝酸纤维素膜 干燥。每张7cm×2.3cm的膜一般可点加40－53个样品，每个压圈可加抗原液1－20μl。
⑵ 封闭 将硝酸纤维素膜置于封闭液中，37℃感作15－30分钟。封闭液多采用含有正常动物血清、pH7.2或pH7.4的PBS。
⑶ 加被检血清 可直接在抗原圈上加，也可剪下抗原圈、置于微量板孔中，再加入一定量适度稀释的待检血清，37℃反应一定时间，用洗涤液洗三次，每次1－3分钟。洗涤液一般为一定浓度的PBS-Tween溶液。
⑷ 加酶标抗体，37℃反应一定时间后，用洗涤液洗三次。
⑸显色 加入新鲜配制的底物液，37℃反应一定时间后，去掉底物液，加蒸馏水洗涤终止反应。
⑹ 结果判定 以阳性、阴险血清作为对照，膜片中央出现深棕红色斑点者为阳性反应，否则为阴性反应。
布ELISA
（C－ELISA） C－ELISA（Cloth-ELISA）是加拿大学者Blais,B. W.等于1989年建立的一种新型免疫检测技术。该方法是以疏水性聚脂布（Hydrophobic Polyester Cloth）即涤纶布为固相载体，这种大孔径的的疏水布具有吸附样品量大，可为免疫反应提供较大的表面积，提高反应的敏感性，且容易洗涤，不需特殊仪器等优点。其基本原理与Dot-ELISA类似，只是载体不同。以对布氏杆菌抗原的检测为例，C－ELISA的主要程序为：
⑴ 首先把抗布氏杆菌的血清包被（吸附）在聚脂布上，并经洗涤及封闭；
⑵ 加被检样品并于室温下感作30分钟，然后洗5次；
⑶ 加酶标记的抗布氏杆菌抗体，于室温下感作30分钟，然后洗涤5次；
⑷ 加入底物液显色；
⑸ 测定OD值。