小鼠肌球蛋白轻链激酶(MLCK/MYLK) ELISA 试剂盒

酶联免疫吸附实验 (ELISA) 是一种定性或定量检测，使用抗体来结合并测定目的分子。与其他免疫检测相似，可使用单克隆抗体和多克隆抗体来检测分析物（如肽、蛋白、抗体和小分子）。抗体对分析物产生特异性，并且一部分（如辣根过氧化物酶 [HRP]）直接或间接偶联抗体，从而提供检测方法并实现可能的信号放大。通过多种ELISA方法和检测化学成份，可以让终端用户调整适当的检测，以解决预计的实验问题。该方法可以用于单份样品检测或高通量筛选。

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直接 ELISA

在直接 ELISA 中，抗原直接结合微孔板表面，随后添加直接偶联的抗体来结合/检测。简而言之，实验步骤的 步便是将抗原固定在微孔板上。 步是添加一种封闭试剂，防止检测抗体出现非特异性结合。接下来，添加直接偶联某种酶（如 HRP）的检测抗体。该检测抗体将结合抗原，并且剩余的抗体会从孔中洗掉。随后添加这种酶的底物，短暂孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。直接 ELISA 的实验步骤有限，可让实验设置整体简化。

直接法优缺点：

优点：1：快速，仅使用一种抗体且步骤较少；2：消除了 抗体的交叉反应性。

缺点：1：一抗的免疫反应性可能受到酶或标签标记的不利影响；2：为每个特定的ELISA系统标记一抗，既费时又昂贵；3：由于标记的抗体密度较低导致较低的灵敏度；4：抗原的固定化不是特异性的，有较高背景干扰。

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间接 ELISA

间接 ELISA 类似于直接 ELISA；但主要的差别在于会通过 偶联抗体来检测结合抗体。实验步骤的 步便是将抗原固定在微孔板上。 步是添加一种封闭试剂，防止结合抗体出现非特异性结合。第三，添加一种抗原特异性结合抗体，短暂孵育后，用缓冲液洗涤板孔，以去除多余的试剂。下一步是“间接”检测，其中添加一种抗体来检测 结合抗体。这种抗体通常偶联某种酶。在孵育和洗涤板孔之后，添加该酶的底物。随后，短暂孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。 抗体通常是一种抗物种抗体。间接 ELISA 的主要优势在于可以使用偶联的 抗体来进行多个实验，前提是在所有不同的实验中使用相同物种的结合抗体。另一个优势是 抗体会放大信号，因为大约 2 个抗体将结合 抗体。随着步骤数量的增加，实验步骤通常会耗时更长，并且更容易出错。此外，背景信号可能会增强，因为所需的试剂数量更多，每一种都可能会出现非特异性结合。

间接法优缺点：

优点：1：可以在一个物种中制备许多一抗，并且可以将相同的标记二抗用于检测；2：由于没有标记，保留了 抗体的 免疫反应性；3：高标记的二抗密度可实现高灵敏度，从而导致信号放大。

缺点：1：二抗可能会发生交叉反应，从而导致非特异性信号；2：这个过程中需要一个额外的孵育步骤

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夹心法 ELISA

在夹心 ELISA 中，抗原成为 2 种抗体之间的“三明治”中心。在一种夹心 ELISA 形式中， 抗体被吸收进入微孔板孔中，在洗涤和封闭后，添加含抗原的样品。添加会结合样品分子另一位点的 抗体。这种 抗体通常偶联某种酶，因此它可用来检测。洗涤板孔之后，添加该酶的底物。随后，短暂反应孵育后，通常在一个读板机上测定每个孔的信号。

夹心法优缺点：

优点：1：高特异性，使用的捕获抗体与检测抗体都是检测特异性的；2：适用于复杂样品，抗原不需要进行纯化即可用于检测；3：灵活性更大，灵敏度更高，可采用直接法也可采用间接法。

缺点：1：检测物需要拥有两个以上不同的抗原表位或多个相同的重复表位：2：价格较贵，时间消耗多。

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竞争性ELISA

竞争性/抑制性 ELISA 也称封闭 ELISA，它对干扰预计信号的程度进行定量，以测定分析物的数量。这样做的一个方法是用一种对靶标有特异性的抗体包被平板。靶标可以偶联某种酶，并用于检测。如果实验含有次于 量的检测靶标，则高浓度的未标记靶标会竞争性地结合，从而减弱信号。这类竞争性实验可用来测定某种特异性分析物的水平。

竞争法优缺点：

优点：1：灵敏度高以及灵活性高；2：能测定微量的分析物。

缺点：1：特异性较低；2：需要酶标记的抗原。

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标记方法
良好的酶结合物取决于两个条件：即高效价的抗体和高活性的酶。抗体的活性和纯度对制备标记抗体至关重要，因为特异性免疫反应随抗体活性和纯度的增加而增强。在酶标记过程中，抗体的活性有所降低，故需要纯度高、效价高及抗原亲和力强的抗体球蛋白， 使用亲和层析提纯的抗体，可提高敏感性，而且可稀释使用，减少非特异性吸附。
酶与抗体交联，常用戊二醛法和过碘酸盐氧化法。郭春祥建立的HRP标记抗体的改良过碘酸钠法简单易行，标记效果好，特别适用于实验室的小批量制备。其标记程序为：将5μg HRP溶于0.5ml蒸馏水中，加入新鲜配制的0.06 mol/L的过碘酸钠（NaIO4）水溶液0.5ml，混匀置4℃冰箱30分钟 ， 取出加入0.16mol/L的乙二醇水溶液0.5ml，室温放置30分钟后加入含5g纯化抗体的水溶液1ml，混匀并装透析袋，以0.05mol/L、pH9.5的碳酸盐缓冲液于4℃冰箱中慢慢搅拌透析6小时（或过夜）使之结合，然后吸出，加硼氢化钠（NaBH4）溶液（5(g/ml)0.2ml，置4℃冰箱2小时，将上述结合物混合液加入等体积饱和硫酸铵溶液，置4℃冰箱30分钟后离心，将所得沉淀物溶于少许0.02mol/L、pH7.4PBS中，并对之透析过夜（4℃），次日离心除去不溶物，即得到酶标抗体，用0.02mol/L、pH7.4PBS稀至5ml，进行测定后，冷冻干燥或低温保存。
效果测定
测定内容包括酶和抗体活性、结合物中酶含量和IgG含量、酶与IgG摩尔比值以及结合率。
⑴ 酶与抗体的活性 常用琼脂扩散或免疫电泳法，使抗原与抗体形成沉淀线，经PBS漂洗1天，再以蒸馏水浸泡1小时，将琼脂凝胶片浸于酶底物溶液中着色，如果出现应有的颜色反应，再用生理盐水浸泡，颜色仍然不褪，表示结合物既有酶的活性，也有抗体活性。良好的结合物在显色后，琼扩滴度应在1:16以上。另一个测定方法是用系列稀释的酶标抗体直接以ELISA方法进行方阵滴定，此法不仅可以测定标记效果，还可以确定酶标抗体的使用浓度。
⑵ 结合物的定量测定 一般是对结合物中的酶和IgG进行定量测定。常用紫外分光光度计于403nm和280nm进行测定，然后按下列公式计算：
酶量（mg/ml）=OD403×0.42
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.4）×0.94×0.62
对于过碘酸钠氧化法制备的标记抗体量，按下列公式计算：
IgG量（mg/ml）=（OD280－OD403×0.34）×0.62
已知酶量和IgG量后，即可计算出标记抗体的摩尔（mol）比值。
HRP/IgG摩尔比值=HRP（mg/ml）/IgG（mg/ml）×4
结合物中酶总量=HRP（mg/ml）×结合物溶液量
结合物产率=结合物中酶总量/标记时加入的酶量×
用于ELISA的结合物的酶量为400(g/ml时效果一般，为500(g/ml时效果较好，达 1000(g/ml时效果 。mol.比值由于结合物中含的IgG并不完全可靠，所以不能作为主要参数。一般认为mol.比值为0.7时效果一般，1.0时效果较好，1.5-2.0时 。酶结合率为 7%时效果一般，为9%－10%较好，达30%以上时 。
ELISA方法的基本类型、用途及操作程序
根据ELISA所用的固相载体而区分为三大类型：一是采用聚苯乙烯微量板为载体的ELISA，即我们通常所指的ELISA（微量板ELISA）；另一类是用硝酸纤维膜为载体的ELISA，称为斑点ELISA（Dot-ELISA）；再一类是采用疏水性聚脂布作为载体的ELISA，称为布ELISA（C－ELISA）。在微量板ELISA中，又根据其性质不同分为间接ELISA、双抗体夹心ELISA、双夹心ELISA、竞争ELISA、阻断ELISA及抗体捕捉ELISA。